Análise de Vitamina A e E no Soro como um Biomarcador de Distúrbios Clínicos

Introdução

A vitamina A (Retinol) e E (Tocoferol) têm papéis importantes nas funções fisiológicas para manter uma boa saúde. Publicações científicas relatam sua potencial implicação em diferentes patogêneses causadas pelo estresse oxidativo. Seu papel como biomarcadores é avaliado. Para grandes estudos epidemiológicos, técnicas analíticas precisas e de alto rendimento são necessárias.

Nosso objetivo para esta nota de aplicação é utilizar um método automatizado de preparação de amostra para a quantificação de vitamina A e E no soro usando uma única operação em LDTD-MS/MS.

O LDTD-MS/MS oferece especificidade combinada com uma análise ultrarrápida para um método de quantificação incomparável. Para desenvolver esta aplicação, nos concentramos em realizar uma preparação de amostra rápida e simples. As vitaminas A e E foram analisadas e os resultados foram obtidos em menos de 8 segundos por amostra.

Método de Preparação da Amostra

Extração automatizada de amostras

Devido à instabilidade das vitaminas A e E, as soluções estoque foram preparadas em etanol (0,1% BHT). O soro agrupado foi exposto à luz ultravioleta por pelo menos 24 horas para fotodegradar a vitamina endógena. O soro exposto reunido foi então adicionado para gerar uma curva de calibração e CQs.

As amostras foram transferidas para tubos com código de barras, legíveis pelo sistema de extração Azeo. Cada frasco com código de barras foi escaneado pelo Azeo Liquid Handler e um arquivo de lote automático foi criado. O sistema de extração Azeo (Figura 1) foi utilizado para extrair as amostras usando as seguintes condições:

• 5 µL de padrão interno (Retinol-d₅ e Tocoferol-d₆ a 10 mg/mL em EtOH (0,1% BHT)) foram adicionados a cada amostra
• 25 µL de amostra de soro foram transferidos dos frascos para uma placa de poços fundos colocada no Lumo Vortexer
  • Misturados por 30 segundos a 1000 rpm
• 25 µL de tampão de extração (0,25 mM NaOH em Isopropanol: Água / 3,5:7,5) foram adicionados a uma placa de poço fundo
  • Misturados por 30 segundos a 1000 rpm
• 300 µL de Hexano foram adicionados em uma placa de poço fundo
  • Misturados por 5 minutos a 1000 rpm
  • Houve uma pausa de 5 minutos para separação de fases
• Foram adicionados 6 µL da fase da camada superior em uma placa de 96 poços LazWell™
  • Secados por 1 minuto em temperatura ambiente com fluxo de ar.
• Foram adicionados 6 µL de hidroxitolueno butilado (BHT, 100 µg/mL em hexano) em uma placa de 96 poços LazWell™
  • Secados por 1 minuto em temperatura ambiente com fluxo de ar.

As seções a seguir foram retiradas da nota de aplicação 2107B para o espectrômetro de massa da Shimadzu. Para todas as aplicações de: « Análises de vitamina A e E no soro como biomarcadores de distúrbios clínicos » (Shimadzu, Thermo e Sciex), baixe o PDF anexado a este artigo.

Resultados e Discussão

Processo de preparação de dados

Espectrômetros de massa são sistemas de aquisição de dados que não foram projetados para lidar com poucos segundos de sinal por amostra. A sequência de sincronização adiciona de 6 a mais de 15 segundos entre cada amostra. Para contornar isso, todas as amostras são adquiridas em um único arquivo (Figura 2). Para permitir a análise desses dados, o software Cascade foi projetado para detectar, dividir e integrar cada pico de amostra adquirido em um único arquivo.

Teste de validação

Curvas de calibração variando de 191 a 2191 ng/mL para Retinol e de 3,1 a 43,1 mg/mL para Tocoferol foram preparadas em soro exposto à luz ultravioleta. Três amostras de soro humano foram usadas como CQ (os valores de concentração endógena foram avaliados com um método de referência e usados como valor nominal). Extrações replicadas foram depositadas em uma placa LazWell™ e secas antes da análise. A área do pico contra a razão do padrão interno (PI) foi usada para normalizar o sinal.

Linearidade

As curvas de calibração foram traçadas usando a razão da área do pico e a concentração nominal dos padrões. Para o teste de linearidade, o seguinte critério de aceitação foi utilizado:

• A regressão linear (r2) deve ser ≥ 0,99

Figura 3 mostra um resultado típico da curva de calibração para Tocoferol. Resultados semelhantes foram obtidos para o Retinol.

Precisão e Exatidão

Para a avaliação da exatidão e precisão, foram utilizados os seguintes critérios de aceitação:

• Cada concentração não deveria exceder 15% CV.
• Cada concentração deveria estar dentro de 100 ± 15% da concentração nominal.

Para o experimento de precisão e exatidão entre corridas, cada CQ foi analisado em triplicata, em cinco dias diferentes. As Tabelas 2 e 3 mostram os resultados de precisão e exatidão entre corridas para Retinol e Tocoferol, respectivamente. O %CV obtido ficou abaixo de 15% e a exatidão ficou dentro de 15% do valor nominal.

Tabela 2 – Precisão e exatidão entre corridas do retinol

Tabela 3 – Precisão e exatidão entre corridas do Tocoferol

Estudo de validação cruzada

Amostras de soro de pacientes reais (N=6) foram testadas com este método para correlacionar com os resultados obtidos por LC-MS/MS tradicional. A porcentagem de diferença entre os valores foi avaliada. Obteve-se uma diferença inferior a 15%. Os resultados são relatados na Tabela 4.

Tabela 4 – Resultado de validação cruzada

Conclusão

O Luxon Ion Source® combinado com o sistema de espectrometria de massa Shimadzu LCMS-8060 permite análises ultrarrápidas (8 segundos por amostra) de Vitamina A e E no soro.